综 述

先天性心脏病（CHD）是最常见的人类发育出生缺陷，指胎儿在胚胎时期的心脏发育异常，通常伴有大血管发育不良，其发病机制复杂，目前尚未阐明。Notch信号通路最早于1917年在果蝇体内发现，其广泛存在于无脊椎动物及脊椎动物中，在各物种进化过程中高度保守^[1]。该通路在哺乳动物心脏的房室管（AVC）、流出道（OFT）、主动脉瓣及心室发育过程中均起到重要的调控作用，可促进心肌细胞再生、参与心脏血管构建，并通过负性调节心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化修复心肌。研究表明，Notch信号通路的异常及Notch基因突变会导致CHD的发生。本文就Notch信号通路参与心脏发育及导致CHD的作用机制展开综述，以期为CHD的早期诊断提供参考。

1 Notch信号通路

Notch信号通路由Notch受体（Notch 1~4），Notch配体（JAG1~2、DLL1~4），细胞内效应器分子［包括CSL（CBF-1/Suppressor of hairless/ Lag-1） DNA结合蛋白、毛发分裂增强因子(Hes)基因家族、Hey（hairy and enhancer-of-split related with YRPW motif）基因］组成^[2-3]；Notch活化过程主要以经典的CBF-1/RBP-JK（C-promoter binding factor 1/recombination signal sequence-binding protein J）依赖途径为主，详见图1。

图1 Notch信号通路活化经典途径

目前，哺乳动物中存在4种Notch基因（Notch 1~4），其中Notch 1~3与人类疾病有关^[4]。动物实验表明，Notch 1在哺乳动物胚胎时期心血管系统的发育过程中发挥重要作用，如在大鼠的胚胎发育阶段，心脏发育最初部位中胚层中即可检测到Notch 1的表达^[5]。同时，Notch 1突变与钙化性主动脉瓣膜病（CAVD）发生率成正相关^[6]。Notch 2突变则会导致Alagille综合征（ALGS）^[7]。而Notch 3与动脉平滑肌细胞发育有关，其突变与显性遗传病有关。

2 Notch信号通路参与心脏发育

Notch在哺乳动物线性心管形成前后的表达特性已被证实。动物实验表明，在大鼠胚胎期第7.5天，Notch 1首先表达于中胚层，第8天后局限于原始心管OFT内膜层，从而调控心脏的形态，Notch 4表达于心内膜，至胚胎期第12.5天可在心室OFT房室区、心房肌和心室肌小梁中检测到JAG1的表达，而Notch 2直到胚胎期第13.5天才出现在心房和心室肌中^[8]。Notch信号通路可参与房室管、心脏传导系统、心室、OFT、冠状动脉的发育。

2.1 房室管形成

在AVC的形成过程中，部分心内膜细胞在临近心肌信号刺激下发生改变，Notch信号通路活化促进细胞上皮——间质转化 (EMT)形成腹侧、背侧两个心内膜垫，二者相对生长、彼此融合将房室总管分隔，同时，心内膜垫也参与瓣膜组织的形成^[9]。Abu等^[10]研究发现，斑马鱼瓣膜组织发育的基因表达与哺乳动物相似，JAG 1b、Hey1、Hey2基因参与编码AVC心内膜关键成分。因此Notch信号通路的活化是诱导EMT的必要条件，促进房室结的形成。

骨形态发生蛋白2（BMP2）是AVC分化和EMT发生的关键信号，BMP2失活则会破坏EMT^[11]。Andrés-Delgado等^[12]研究发现，心肌中Notch 1异位激活导致非腔室心肌表达Hey1，从而抑制BMP2的表达并破坏瓣膜EMT，而心内膜细胞中Notch 1可上调AVC心肌中BMP2的表达，二者呈正相关。

此外，Notch信号通路靶基因Hey1通过抑制BMP2在房室中的表达，将其和Tbx 2的表达限制于AVC中，进而促进AVC的成熟，影响房室总管的分隔以及房室瓣的形成^[13]。因此，Notch信号通路在心脏发育的不同部位对BMP2的调控作用有所差异，可将BMP2及促AVC形成相关基因限制于AVC中，以促进AVC的发育。

2.2 心脏传导系统发育

在心脏起搏点窦房结（SAN）形成过程中，Notch 1信号在SAN的心内膜中募集。Wang等^[14]研究发现，在心脏发育过程中，静脉窦瓣（SVV）与SAN共同发育，而在Notch 1基因敲除的胚胎心肌SVV中Wnt2基因表达明显降低，说明Wnt2可通过Wnt/β-catenin信号通路参与SVV的形成。因此，Notch 1可上调Wnt信号促进SVV与SAN的形成。

2.3 心室发育

早期心室发育首先是心肌小梁的形成，而Notch 1存在于小梁底部的心室心内膜细胞中，其活性可影响BMP10的表达，进而调控心肌细胞增殖。

此外，Notch信号通路还影响激活心肌小梁形成的EFNB2通路和神经调节素1（NRG1）-ERBB通路，心内膜Notch通路通过作用于神经嵴衍生物表达蛋白2（HAND2）调控NRG1的表达，而EFNB2是NRG1的上游因子，在免疫球蛋白Kappa J区重组信号结合蛋白（RBPJ）突变体中外源性给予NRG1可恢复心肌细胞分化缺陷^[13]，说明NRG1可促进心肌小梁形成^[15]；

另有研究发现，早期心室发育中的DLL4向β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶Manic Fringe（β-1,3-N-acetylglucosaminyltransfe-rase manic fringe，MFNG）重组蛋白修饰的Notch 1受体发出信号并促进心肌压紧^[13]。动物实验表明，小鼠胚胎心肌细胞表达的Hey2可促进致密心肌细胞向小梁层扩张，进而促进内小梁和外致密层之间心肌杂交带的形成以及心室压实^[16]。

综上，Notch信号通路可通过调控BMP10、EFNB2通路、NRG1-ERBB通路中相关蛋白表达以及上调下游基因促进早期心室发育。

2.4 OFT发育

Notch信号通路在第二心野（SHF）衍生的心脏结构中发挥关键作用。SHF是指心脏发育所需心脏祖细胞的第二来源，其对心肌、心内膜以及间充质细胞均有影响，而这些细胞可形成OFT结构。Notch 1可下调SHF阳性细胞Wnt/β-catenin信号传导以促进SHF中的心脏祖细胞分化^[13]。

De Zoysa等^[17]研究发现，在小鼠心脏发育早期敲除DLL4后会导致SHF细胞凋亡率上升4倍以及OFT发育不足。Rammah等^[18]发现，Notch配体、Notch 1以及非经典的配体DLK1 (delta-like noncanonical Notch ligand 1)通路可负调控过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ），从而保证OFT正常发育。因此，Notch信号通路可通过促进Wnt信号通路及DLL4促进SHF分化，同时其配体及受体可直接促进OFT发育。

2.5 冠状动脉发育

Notch信号通路与心脏冠状动脉发育有关，参与冠脉血管壁的形成。血管内皮生长因子（VEGF）在血管形成中发挥重要作用，其通过结合血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR-2）促进血管出芽，而Notch受体可抑制VEGFR-2的表达，Notch配体DLL4可抑制血管新生芽的形成^[19]。

Travisano等^[20]研究发现，Notch配体JAG1和DLL4拮抗调节冠状动脉初级动脉丛的形成，且EphrinB2是拮抗过程中的关键效应因子，随后的冠状动脉分化依赖于DLL4-JAG1-EphrinB2信号级联反应。

此外，Notch信号通路通过调节心外膜细胞向上皮细胞-间充质的转化影响冠状动脉平滑肌细胞分化，其作用于转化生长因子-β（TGF-β）的上游信号^[21]，TGF-β可与Notch信号通路共同调控冠状动脉的正常发育^[22]。

McCallinhart等^[23]首次发现，Notch配体JAG1及其受体可在冠状动脉肌内皮连接（MEJ）内表达，平滑肌可借助于该连接，接受血液或内皮细胞的化学信息。因此，Notch信号通路可通过双重调节VEGF来调控血管出芽，其与配体结合通过EphrinB2拮抗调节冠状动脉初级动脉丛的形成，促进冠状动脉分化，同时也可作用于TGF-β上游信号促进冠状动脉形成。

3 Notch信号通路与CHD

3.1 CHD概述

CHD是先天性疾病中较常见的一类。根据《常见先天性心脏病经皮介入治疗指南(2021版) 》，CHD包括室间隔缺损（VSD）、房间隔缺损（ASD）、动脉导管未闭（PDA）、肺动脉狭窄（PS）、法洛四联症（TOF）、左心发育不全综合征（HLHS）等^[24]。全球新生儿中CHD患病以VSD、ASD为主^[25]。上述研究表明，Notch信号通路能够作用于心脏发育各个阶段，Notch基因突变与CHD发病密切相关。

3.2 Notch信号通路异常导致CHD

3.2.1 HLHS

HLHS是以左心室、二尖瓣、主动脉瓣和升主动脉左心部分发育不良为特征的严重单心室CHD。研究表明，Notch靶基因启动子位点赖氨酸甲基转移酶2D(KMT2D)缺陷会导致HLHS患者冠状动脉畸形^[26]。此外，Notch信号通路异常会导致瓣膜形成异常^[27]，SHF祖细胞中HAND2和Hey2基因缺失分别导致三尖瓣闭锁（TA）和VSD^[28]。如阻断心内膜Notch-RBPJ通路会造成RBPJ表达缺失及VSD^[29]。因此，Notch下游靶基因缺陷导致冠状动脉畸形从而引起左心部分发育不良，此外Notch信号通路异常使下游信号缺失可导致瓣膜形成异常以及VSD。

3.2.2 TOF

TOF是具有PS、VSD、主动脉骑跨以及右心室肥大4种异常表现的紫绀型先天性心脏畸形。Page等^[30]发现，Notch 1基因位点变异会引发非典型性TOF。研究表明，TOF患者右心室OFT蛋白δ样DLK1的表达显著低于对照组，DLK1启动子低甲基化从而抑制DLK1基因的转录活性导致TOF^[31]，提示Notch 1基因位点变异以及Notch配体基因转录活性下降均会导致TOF。

3.2.3 PDA

PDA是婴儿出生后动脉导管持续未闭保持开放的病理状态，常合并血管畸形，严重时可表现为艾森曼格综合征。Ovali等^[32]研究发现，Notch受体对小鼠收缩性平滑肌细胞分化发挥正性作用。此外，JAG1-Notch信号轴也存在于平滑肌细胞中，在血管发育期间可促进平滑肌细胞分化及导管的解剖闭合^[33]。因此，Notch受体与配体均可正性调节血管平滑肌细胞分化，其缺失会导致有特定作用的细胞相关基因表达下调，从而影响动脉导管解剖重塑，进而导致PDA。

3.2.4 二叶式主动脉瓣病变

二叶式主动脉瓣病变（BAV）在CHD中的发病率仅为1％~2%，目前相关研究较少，病因尚不明确。Kostina等^[34]研究发现，左心室OFT畸形患者中Notch 1基因突变与BAV相关，BAV患者主动脉内皮细胞主动下调Notch信号，且所有Notch配体均无法上调EMT，导致Notch信号通路异常，从而引起内皮功能障碍及主动脉壁改变。

在BAV患者升主动脉活检过程中发现， Sirtuin 1 （SirT1）的激活与Notch信号通路之间存在负反馈调节^[35]。对SirT1敲除小鼠进行研究发现，该小鼠在产前或围产期会死于心脏瓣膜畸形，表明SirT1参与心脏发育与瓣膜形成^[36]。综上，这些分子或可作为潜在生物标志物，为BAV的早期诊断提供新思路。

3.2.5 CAVD

Ackah 等^[37]研究发现，在非综合征型常染色体显性遗传的人类家系中，Notch 1突变会引起一系列发育性主动脉瓣异常和严重的瓣膜钙化，Notch 1的转录本在正在发育的小鼠主动脉瓣中表现活跃，Notch 1信号通路激活的毛发相关转录抑制因子（Hrt）家族与转录因子Runx2相互作用，抑制Runx2转录活性，而Runx2与主动脉瓣钙化密切相关，是成骨细胞的核心转录调节因子。

另有研究表明，Notch 1突变可导致钙盐沉积的去抑制，进而导致主动脉瓣钙化^[38]。Acharya等^[39]对离体猪主动脉瓣钙化模型进行研究发现，抑制Notch信号活性则钙化加速，同时主动下调Notch信号后，转录因子Sox9及其靶基因表达显著下调，反之，刺激Notch信号则钙化减慢，说明Notch信号通路异常可通过不同途径导致主动脉瓣钙化。

3.2.6 ALGS

研究表明，JAG1和Notch 2突变会导致ALGS的发生，且大多数Notch 2突变是错义突变^[40]。Gilbert等^[41]研究发现，ALGS患者中约94.5％存在JAG1突变（包括错义突变、无义突变、剪接突变等），2.5％的患者存在Notch 2突变，为临床诊断提供了新思路。动物实验表明，小鼠JAG1纯合突变为致死性突变，而JAG1杂合小鼠仅表现为眼部异常，无心脏异常表现，Notch 2单倍剂量不足的小鼠则表现为ALGS特征性多系统病变^[42]，这表明Notch 2及JAG1对心脏发育均具有重要意义。

4 小结与展望

综上所述，Notch信号通路在心脏生长发育时期发挥重要调节作用，影响心脏的形态结构及正常功能。该通路异常可通过介导HAND2、Runx2等因子的缺失以及JAG、DLK1等的异常表达导致CHD，未来或可进一步对这一通路的下游信号分子进行检测，从而提高胎儿CHD的检出率。

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